Next Generation Sequencing (NGS)

Next Generation Sequencing (NGS)

Per sequenziamento genetico di nuova generazione (Next generation sequencing, NGS) si intende l’insieme delle tecnologie di sequenziamento degli acidi nucleici che hanno in comune la capacità di sequenziare, in parallelo, milioni di frammenti di DNA.

Queste tecnologie hanno segnato una svolta rivoluzionaria nella possibilità di caratterizzare genomi di grandi dimensioni rispetto al metodo di sequenziamento del DNA di prima generazione (sequenziamento Sanger), grazie alla potenzialità di produrre, in un’unica seduta di analisi, una quantità di informazioni genetiche milioni di volte più grande.

L’entità del progresso molecolare si comprende quando si analizzano tempi e costi richiesti per il sequenziamento di un genoma umano nell’era pre- e post-NGS. 3 miliardi di dollari e 13 anni di lavoro di 20 diverse università e centri di ricerca si sono resi necessari per completare nel 2003 la caratterizzazione di un genoma umano per lo “Human genome project”. Oggi, a pochi anni di distanza, le tecnologie NGS più avanzate consentono il sequenziamento di un genoma umano in pochi giorni al costo di circa 1.000 dollari.

Ma l’impatto della rivoluzione NGS è evidente anche nel mondo della sicurezza alimentare e della sanità animale. Il genoma completo di molteplici specie di animali è ora disponibile nelle banche dati pubbliche e lo sono anche i genomi dei patogeni isolati da alimenti e da animali (virus, batteri, funghi e parassiti), offrendo innumerevoli opportunità di approfondimento scientifico nell’ambito della salute animale e pubblica.

Attività, laboratori e referentiApprofondimentiPubblicazioniNews

Attività e laboratori IZSVe con tecnologie NGS

L’Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie ha accesso diretto alla tecnologia NGS su piattaforma Illumina e ha acquisito e sviluppato un’infrastruttura informatica volta alla gestione ed analisi dei dati NGS. La disponibilità tecnologica e computazionale unita alla presenza di un team specializzato multidisciplinare afferente alle strutture SCS1 – Microbiologia generale e sperimentale e SCS5 – Ricerca e innovazione, consente di offrire all’utenza interna ed esterna un servizio di sequenziamento NGS completo che spazia dalla progettazione dell’esperimento all’analisi bioinformatica del dato generato.

Presso i laboratori dell’IZSVe sono disponibili a fini di ricerca e di diagnostica le seguenti applicazioni:

  • sequenziamento acidi nucleici di sintesi (prodotti di PCR) (SCS5);
  • analisi del microbiota (analisi della composizione di comunità microbiche complesse a partire da qualsiasi matrice (SCS1);
  • analisi del microbioma (analisi della composizione genetica di comunità microbiche complesse a partire da qualsiasi matrice) (SCS1);
  • whole genome sequencing (WGS) batterico (analisi dell’intero genoma batterico a partire da singoli isolati) (SCS1);
  • whole genome sequencing virale (SCS5);
  • metagenomica virale (SCS5);
  • preparazione librerie ed analisi bioinformatica di miRNA,di mRNA e di DNA (SCS1 ed SCS5);
  • approccio ultra-deep sequencing per studi di diversità genetica delle popolazioni virali (SCS5).

Grazie allo sviluppo e all’implementazione dell’infrastruttura NGS, l’IZSVe ha potuto partecipare a progetti di ricerca nazionali e internazionali che hanno consentito:

  • di comprendere le dinamiche di trasmissione ed evolutive di importanti epizoozie;
  • di sviluppare nuovi approcci diagnostici per l’identificazione e la caratterizzazione di patogeni emergenti;
  • di esplorare l’impatto della vaccinazione e dei trattamenti antimicrobici sull’evoluzione dei patogeni;
  • di caratterizzare il microbiota e il microbioma in ospiti vertebrati ed invertebrati e in matrici ambientali

Referenti IZSVe per le tecnologie NGS

Carmen Losasso
Biologo dirigente
Laboratorio ecologia microbica e genomica dei microrganismi
SCS1 – Microbiologia generale e sperimentale
Tel. 049 8084137 | email: closasso@izsvenezie.it

Isabella Monne
Medico veterinario dirigente
Laboratorio genomica e trascrittomica virale
SCS5 – Ricerca e innovazione
Tel. 049 8084381 | E-mail: imonne@izsvenezie.it

Approfondimenti sulle tecnologie NGS

Metatassonomica

La metatassonomica è una branca della metagenomica che studia la composizione in unità tassonomiche di comunità microbiche residenti in matrici complesse. Si tratta di una metodologia di indagine diretta, cioè non necessità dello step di coltivazione dei microrganismi su terreno di coltura, e dunque consente di identificare con una certa approssimazione tutti i membri della comunità microbica, incluse le specie non coltivabili e quelle rare.

La rappresentazione della composizione della comunità microbica avviene solitamente attraverso il sequenziamento del gene codificante per l’rRNA16, una componente del ribosoma dei procarioti dotato di regioni altamente specie-specifiche, la cui sequenza dunque può essere associata con elevata confidenza alla specie di appartenenza.

Attraverso analisi metatassonomiche è possibile conoscere il grado di (bio)diversità di comunità microbiche residenti in matrici e ambienti differenti e studiare le relazioni che esistono tra i microrganismi che fanno parte della stessa comunità, siano essi residenti o contaminanti.

Whole genome sequencing (WGS) batterico

Il Whole-genome sequencing (WGS) è una metodologia che permette di conoscere la composizione nucleotidica dell’intero genoma di un microrganismo. Il WGS associato ad informazioni di tipo epidemiologico rappresenta la metodologia più avanzata per identificare e analizzare le rotte di diffusione dei microrganismi patogeni e per collegare i focolai zoonosici alle fonti di infezione. La tipizzazione dei microrganismi patogeni e la possibilità di predirne il fenotipo sulla base dell’analisi della composizione dell’intero genoma rappresentano, infatti, strumenti essenziali per la sorveglianza delle zoonosi.

In aggiunta l’analisi della composizione del genoma dei microrganismi permette di studiare caratteristiche associate alla specificità di ogni ceppo microbico, quali tra gli altri la virulenza, l’invasività, l’antibiotico resistenza, la capacità di formare biofilm, la tolleranza ai metalli e la persistenza nell’ambiente, rendendo possibile l’applicazione non solo alla sorveglianza epidemiologica ma anche al monitoraggio e alla caratterizzazione dei microrganismi patogeni nelle filiere di produzione degli alimenti.

L’analisi WGS si compone di vari step quali: l’ottenimento di una coltura pura del microrganismo di interesse; l’estrazione del DNA; la preparazione di librerie genomiche del campione; l’amplificazione delle stesse; il sequenziamento attraverso piattaforme next generation; l’analisi dei dati e infine l’interpretazione biologica. Data la complessità dell’analisi, è necessaria la collaborazione tra figure professionali diverse ed altamente specializzate.

Pubblicazioni IZSVe con tecnologie NGS

  • Cibin V., Busetti M., Longo A. , Petrin S., Knezevich  A., Ricci A., Barco L., Losasso C. (2019) Whole genome sequencing of Salmonella serovar Stanleyville from two Italian outbreaks resulted in unexpected genomic diversity within and between outbreaks. Foodborne pathogens and diseases, 16, doi.org/10.1089/fpd.2018.2564
  • Petrin S. , Longo A., Barco L., Cortini E., Peruzzo A., Antonelli P., Ramon E., Cibin V., Lettini A A, Ricci A. and Losasso C. (2018) Different Resolution Power of Multilocus Variable-Number Tandem Repeats Analysis (MLVA) and Whole Genome Sequencing (WGS) in the Characterization of S. 1,4,[5],12:i:- Isolates. Foodborne pathogens and diseases, in press
  • Losasso C., Eckert E., Mastrorilli M., Villiger J., Mancin M., Patuzzi I., Di Cesare A., Cibin V., Barrucci F., Pernthaler J., Corno G. and Ricci A. (2018) Assessing the influence of vegan, vegetarian and omnivore oriented westernized dietary styles on human gut microbiota: a cross sectional study FRONTIERS IN MICROBIOLOGY,9:317. doi: 10.3389/fmicb.2018.00317. eCollection 2018
  • Losasso C., Di Cesare A., Mastrorilli E., Patuzzi I., Cibin V., Eckert EM, Fontaneto D., Vanzo A., Ricci A., Corno G. (2018). Assessing antibiotic resistance gene load in vegan, vegetarian and omnivore human gut microbiota. Journal of Antimicrobial Agents
  • Di Cesare A., Petrin S., Fontaneto D., Losasso C., Eckert EM,, Tassistro G., Borello A., Ricci A., Wilson WH, Pruzzo C., Vezzulli L. (2018). ddPCR applied on archived Continuous Plankton Recorder samples reveals long‐term occurrence of class 1 integrons and a sulphonamide resistance gene in marine plankton communities. Environmental microbiology reports. 10(4):458-464. doi: 10.1111/1758-2229.12665
  • Ricci R., Conficoni D., Morelli G., Losasso C., Alberghini L., Giaccone V., Ricci A., Andrighetto I. (2018). Undeclared animal species in dry and wet novel and hydrolyzed protein diets for dogs and cats detected by microarray analysis. BMC veterinary research, 14
  • Mastrorilli E., Pietrucci D., Barco L., Ammendola S., Petrin S., Longo A., Mantovani C., Battistoni A., Ricci A., Desideri A and Losasso C. (2018). A comparative genomic analysis provides novel insights into the ecological success of the monophasic Salmonella serovar 4,[5],12:i:- . Frontiers in microbiology, 9:715. doi: 10.3389/fmicb.2018.00715
  • Losasso C., Eckert E., Mastrorilli M., Villiger J., Mancin M., Patuzzi I., Di Cesare A., Cibin V., Barrucci F., Pernthaler J., Corno G. and Ricci A. (2018). Assessing the influence of vegan, vegetarian and omnivore oriented westernized dietary styles on human gut microbiota: a cross sectional study Frontiers in microbiology,9:317
  • Zecchin B, Minoungou G, Fusaro A, Moctar S, Ouedraogo-Kaboré A, Schivo A, Salviato A, Marciano S, Monne I. Influenza A(H9N2) Virus, Burkina Faso. Emerg Infect Dis. 2017 Dec;23(12):2118-2119. doi: 10.3201/eid2312.171294. Epub 2017 Dec 17.
  • Fusaro A, Monne I, Mulatti P, Zecchin B, Bonfanti L, Ormelli S, Milani A, Cecchettin K, Lemey P, Moreno A, Massi P, Dorotea T, Marangon S, Terregino C. Genetic Diversity of Highly Pathogenic Avian Influenza A(H5N8/H5N5) Viruses in Italy, 2016-17. Emerg Infect Dis. 2017 Sep;23(9):1543-1547. doi: 10.3201/eid2309.170539. Epub 2017 Sep 17.
  • Laleye A, Joannis T, Shittu I, Meseko C, Zamperin G, Milani A, Zecchin B, Fusaro A, Monne I, Abolnik C. A two-year monitoring period of the genetic properties of clade 2.3.2.1c H5N1 viruses in Nigeria reveals the emergence and co-circulation of distinct genotypes. Infect Genet Evol. 2017 Nov 15;57:98-105. doi: 10.1016/j.meegid.2017.10.027. [Epub ahead of print]
  • Milani A, Fusaro A, Bonfante F, Zamperin G, Salviato A, Mancin M, Mastrorilli E, Hughes J, Hussein HA, Hassan M, Mundt E, Terregino C, Cattoli G, Monne I. Vaccine immune pressure influences viral population complexity of avian influenza virus during infection. Vet Microbiol. 2017 May;203:88-94. doi: 10.1016/j.vetmic.2017.02.016. Epub 2017 Feb 27.
  • Beato MS, Tassoni L, Milani A, Salviato A, Di Martino G, Mion M, Bonfanti L, Monne I, Watson SJ, Fusaro A. Circulation of multiple genotypes of H1N2 viruses in a swine farm in Italy over a two-month period. Vet Microbiol. 2016 Nov 15;195:25-29. doi: 10.1016/j.vetmic.2016.08.015. Epub 2016 Sep 7.
  • Fusaro A, Tassoni L, Milani A, Hughes J, Salviato A, Murcia PR, Massi P, Zamperin G, Bonfanti L, Marangon S, Cattoli G, Monne I. Unexpected Interfarm Transmission Dynamics during a Highly Pathogenic Avian Influenza Epidemic. J Virol. 2016 Jun 24;90(14):6401-11. doi: 10.1128/JVI.00538-16. Print 2016 Jul 15.
  • Leopardi S, Oluwayelu D, Meseko C, Marciano S, Tassoni L, Bakarey S, Monne I, Cattoli G, De Benedictis P. The close genetic relationship of lineage D Betacoronavirus from Nigerian and Kenyan straw-colored fruit bats (Eidolon helvum) is consistent with the existence of a single epidemiological unit across sub-Saharan Africa. Virus Genes. 2016 Aug;52(4):573-7. doi: 10.1007/s11262-016-1331-0. Epub 2016 Apr 8.
  • Fusaro A, Tassoni L, Hughes J, Milani A, Salviato A, Schivo A, Murcia PR, Bonfanti L, Cattoli G, Monne I. Evolutionary trajectories of two distinct avian influenza epidemics: Parallelisms and divergences. Infect Genet Evol. 2015 Aug;34:457-66. doi: 10.1016/j.meegid.2015.05.020. Epub 2015 May 20.
  • Van Borm S, Belák S, Freimanis G, Fusaro A, Granberg F, Höper D, King DP, Monne I, Orton R, Rosseel T. Next-generation sequencing in veterinary medicine: how can the massive amount of information arising from high-throughput technologies improve diagnosis, control, and management of infectious diseases? Methods Mol Biol. 2015;1247:415-36. doi: 10.1007/978-1-4939-2004-4_30. Review.
  • Monne I, Fusaro A, Nelson MI, Bonfanti L, Mulatti P, Hughes J, Murcia PR, Schivo A, Valastro V, Moreno A, Holmes EC, Cattoli G. Emergence of a highly pathogenic avian influenza virus from a low-pathogenic progenitor. J Virol. 2014 Apr;88(8):4375-88. doi: 10.1128/JVI.03181-13. Epub 2014 Feb 5.

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